catalКатализ в промышленностиKataliz v promyshlennosti1816-03872413-6476LLC "KALVIS"10.18412/1816-0387-2017-6-554-560catal-484Research ArticleБИОКАТАЛИЗBIOCATALYSISСвойства химерной полисахаридмонооксигеназы с присоединенным целлюлозосвязывающим модулем и ее применение для гидролиза целлюлозосодержащего сырья в составе целлюлазного комплексаChimeric Polysaccharide of Monooxygenase with Attached Cellulose-Binding Module: Properties and Application for Hydrolysis of Cellulose-Containing Feedstock in the Composition of Cellulase ComplexБулаховА. Г.BulakhovA. G.ctls@kalvis.ruГусаковА. В.GusakovA. V.ctls@kalvis.ruРожковаА. М.RozhkovaA. M.ctls@kalvis.ruВолковП. В.VolkovP. V.ctls@kalvis.ruМатысВ. Ю.MatysV. Yu.ctls@kalvis.ruЗоровИ. Н.ZorovI. N.ctls@kalvis.ruСиницынА. П.SinitsynA. P.ctls@kalvis.ruФИЦ Биотехнологии РАН, МоскваRussian FederationФИЦ Биотехнологии РАН, Москва; Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова (МГУ)Russian FederationИнститут биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (ИБФМ РАН), ПущиноRussian Federation201708122017176554560Copyright © LLC "KALVIS", 20172017LLC "KALVIS"LLC "KALVIS"https://www.catalysis-kalvis.ru/jour/about/submissions#copyrightNoticehttps://www.catalysis-kalvis.ru/jour/article/view/484

Использование открытых несколько лет назад полисахаридмонооксигеназ (ПМО) в составе целлюлазных комплексов существенно увеличивает их осахаривающую способность. Методом генетической инженерии нами был получен химерный фермент на основе ПМО Thielavia terrestris, к С-концу которого присоединен через пептидный линкер целлюлозосвязывающий модуль (ЦСМ) от целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum. Химерная ПМО обладала более высокой (на 24 %) активностью по отношению к аморфной целлюлозе и расширенной субстратной специфичностью по сравнению с исходной ПМО. В результате присоединения ЦСМ химерная ПМО приобрела способность расщеплять помимо целлюлозы и β-глюкана ксилан и карбоксиметилцеллюлозу, а ее активность по отношению к ксилоглюкану возросла на порядок. При замене 10 % высокоактивного целлюлазного препарата hBGL2, продуцируемого P. verruculosum, на химерную ПМО при сохранении общей дозировки ферментов по концентрации белка выход сахаров при гидролизе микрокристаллической целлюлозы и измельченной осиновой древесины увеличился на 24 и 47 % соответственно, причем при деструкции древесины максимальный выход сахаров был достигнут через 24 ч реакции в отличие от гидролиза указанным препаратом без добавки ПМО, длящегося 48 ч.

Polysaccharide monooxygenases (PMO) was discovered several years ago in the composition of cellulase complexes to improve their saccharification capacity considerably. Methods of genetic engineering were used for creation of a chimeric PMO Thielavia terrestris based on enzyme with a cellulose-binding module (CBM) from cellobiohydrolase I Penicillium verruculosum attached through a peptide linker to the C-end. The chimeric PMO was more active (by 24 %) to amorphous cellulose and wider substrate specific than the initial PMO. With the attachedCBM, the chimeric PMO became capable of cleaving not only cellulose and β-glucane, but also xylane and CMC, while its activity to xyloglucane increased by an order of magnitude. In hydrolysis of MCC and aspen sawdust, when the chimeric PMO was substituted for 10 % of the highly active cellulase preparation hBGL2 produced by P. verruculosum at the retained total enzyme dosage with respect to the protein concentration, the yield of sugars increased by 24 and 47 %, respectively, the maximal sugar yield being reached in 24 hours of the reaction against 48 hours in the presence of the PMO-free preparation.

химерная полисахаридмонооксигеназацеллюлазный комплексбиоконверсия растительного сырьяThielavia terrestrisPenicillium verruculosumchimeric polysaccharide monooxygenasescellulase complexbioconversion of plant materialsThielavia terrestrisPenicillium verruculosumReferencesMargeot A., Hahn-Hagerdal B., Edlund M., Slade R., Monot F. // Current Opinion in Biotechnology. 2009. Vol. 20. P. 372—380.Margeot A., Hahn-Hagerdal B., Edlund M., Slade R., Monot F. // Current Opinion in Biotechnology. 2009. Vol. 20. P. 372—380.Merino S.T., Cherry J. // Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 2007. Vol. 108. P. 95—120.Merino S.T., Cherry J. // Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 2007. Vol. 108. P. 95—120.Sims R.E.H., Mabee W., Saddler J.N., Taylor M. // Bioresource Technology. 2010. Vol. 101. P. 1570—1580.Sims R.E.H., Mabee W., Saddler J.N., Taylor M. // Bioresource Technology. 2010. Vol. 101. P. 1570—1580.Zifcakova. L., Baldrian P. // Fungal Ecology. 2012. Vol. 5. P. 481—489. 5. Kim I.J., Nam K.H., Yun E.J., Kim S., Youn H.J., Lee H.J., Choi I.G., Kim K.H. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2015. Vol. 99. P. 8537—8547.Zifcakova. L., Baldrian P. // Fungal Ecology. 2012. Vol. 5. P. 481—489. 5. Kim I.J., Nam K.H., Yun E.J., Kim S., Youn H.J., Lee H.J., Choi I.G., Kim K.H. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2015. Vol. 99. P. 8537—8547.Proskurina O.V., Korotkova O.G., Rozhkova A.M., Kondrat'eva E.G., Matys V.Y., Zorov I.N., Koshelev A.V., Okunev O.N., Nemashkalov V.A., Bubnova T.V., Sinitsyn A.P. // Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. Vol. 51. P. 666—673.Proskurina O.V., Korotkova O.G., Rozhkova A.M., Kondrat'eva E.G., Matys V.Y., Zorov I.N., Koshelev A.V., Okunev O.N., Nemashkalov V.A., Bubnova T.V., Sinitsyn A.P. // Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. Vol. 51. P. 666—673.Булахов А.Г., Гусаков А.В., Чекушина А.В., Сатрутдинов А.Д., Кошелев А.В., Матыс В.Ю., Синицын А.П. // Биохимия. 2016. Т. 81. С. 530—537.Булахов А.Г., Гусаков А.В., Чекушина А.В., Сатрутдинов А.Д., Кошелев А.В., Матыс В.Ю., Синицын А.П. // Биохимия. 2016. Т. 81. С. 530—537.Phillips M.C., Beeson W.T., Cate J.H.D., Marletta M.A. // ACS Chemical Biology. 2011. Vol. 6. P. 1399—1406.Phillips M.C., Beeson W.T., Cate J.H.D., Marletta M.A. // ACS Chemical Biology. 2011. Vol. 6. P. 1399—1406.Levasseur A., Drula, E., Lombard, V., Coutinho P.M., Henrissat B. // Biotechnology for Biofuels. 2013. Vol. 6. No. 41. P. 1—14.Levasseur A., Drula, E., Lombard, V., Coutinho P.M., Henrissat B. // Biotechnology for Biofuels. 2013. Vol. 6. No. 41. P. 1—14.Quinlan R.J., Sweeney M.D., Leggio L.L., Otten H., Poulsen J.C., Johansen K.S., Krogh K.B., Jorgensen C.I., Tovborg M., Anthonsen A., Tryfona T., Walter C.P., Dupree P., Xu F., Davies G.J., Walton P.H. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2011. Vol. 108, P. 15079—15084.Quinlan R.J., Sweeney M.D., Leggio L.L., Otten H., Poulsen J.C., Johansen K.S., Krogh K.B., Jorgensen C.I., Tovborg M., Anthonsen A., Tryfona T., Walter C.P., Dupree P., Xu F., Davies G.J., Walton P.H. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2011. Vol. 108, P. 15079—15084.Tanghe M., Danneels B., Camattari A., Glieder A., Vandenberghe I., Devreese B., Stals I., Desmet T. // Molecular Biotechnology. 2015. Vol. 57. P. 1010—1017.Tanghe M., Danneels B., Camattari A., Glieder A., Vandenberghe I., Devreese B., Stals I., Desmet T. // Molecular Biotechnology. 2015. Vol. 57. P. 1010—1017.Morozova V.V., Gusakov A.V., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. // Journal of Biotechnology. 2010. Vol. 5. P. 871—880.Morozova V.V., Gusakov A.V., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. // Journal of Biotechnology. 2010. Vol. 5. P. 871—880.Crouch L.I., Labourel A., Walton P.H., Davies G.J., Gilbert H.J. // The Journal of Biological Chemistry. 2016. Vol. 291. No. 14, P. 7439—7449.Crouch L.I., Labourel A., Walton P.H., Davies G.J., Gilbert H.J. // The Journal of Biological Chemistry. 2016. Vol. 291. No. 14, P. 7439—7449.Пат. РФ 2378372. 10.01.2010; Бюл. № 1.Пат. РФ 2378372. 10.01.2010; Бюл. № 1.Dotsenko A.S., Gusakov A.V., Volkov P.V., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P. // Biotechnology and Bioengineering. 2016. Vol. 113. P. 283-291.Dotsenko A.S., Gusakov A.V., Volkov P.V., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P. // Biotechnology and Bioengineering. 2016. Vol. 113. P. 283-291.Aslanidis C., de Jong P.J. // Nucleic Acids Research. 1990. Vol. 18. P. 6069—6074.Aslanidis C., de Jong P.J. // Nucleic Acids Research. 1990. Vol. 18. P. 6069—6074.Sanger F., Nicklen S., Chase A.R. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1977. Vol. 74. Р. 5463—5467.Sanger F., Nicklen S., Chase A.R. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1977. Vol. 74. Р. 5463—5467.Мерзлов Д.А., Зоров И.Н., Доценко Г.С., Денисенко Ю.А., Рожкова А.М., Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А., Кондратьева Е.Г, Синицын А.П. // Биохимия. 2015. Т. 80, № 4. С. 556—567.Мерзлов Д.А., Зоров И.Н., Доценко Г.С., Денисенко Ю.А., Рожкова А.М., Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А., Кондратьева Е.Г, Синицын А.П. // Биохимия. 2015. Т. 80, № 4. С. 556—567.Aleksenko A., Makarova N., Nikolaev I., Clutterbuck A. // Current Genetics. 1995. Vol. 28. P. 474—478.Aleksenko A., Makarova N., Nikolaev I., Clutterbuck A. // Current Genetics. 1995. Vol. 28. P. 474—478.James P.E. Proteome Research: Mass Spectrometry. Berlin: Springer-Verlag. 2001. 274 p.James P.E. Proteome Research: Mass Spectrometry. Berlin: Springer-Verlag. 2001. 274 p.Bulakhov A.G., Volkov P.V., Rozhkova A.M., Gusakov A.V., Nemashkalov V.A., Satrutdinov A.D., Sinitsyn A.P. Using an inducible promoter of a gene encoding Penicillium verruculosum glucoamylase for production of enzyme preparations with enhanced cellulase performance // PLoS ONE. 2017. Vol. 12. No. 1. e0170404.Bulakhov A.G., Volkov P.V., Rozhkova A.M., Gusakov A.V., Nemashkalov V.A., Satrutdinov A.D., Sinitsyn A.P. Using an inducible promoter of a gene encoding Penicillium verruculosum glucoamylase for production of enzyme preparations with enhanced cellulase performance // PLoS ONE. 2017. Vol. 12. No. 1. e0170404.Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1990. Т. 25. С. 30—37.Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1990. Т. 25. С. 30—37.Frommhagen M., Sforza S., Westphal A.H., Visser J., Hinz S.W.A., Koetsier M.J., van Berkel W.J.H., Gruppen H., Kabel M.A. // Biotechnology for Biofuels. 2015. Vol. 8. No. 101. P. 1-12.Frommhagen M., Sforza S., Westphal A.H., Visser J., Hinz S.W.A., Koetsier M.J., van Berkel W.J.H., Gruppen H., Kabel M.A. // Biotechnology for Biofuels. 2015. Vol. 8. No. 101. P. 1-12.

The authors declare that there are no conflicts of interest present.