Свойства химерной полисахаридмонооксигеназы с присоединенным целлюлозосвязывающим модулем и ее применение для гидролиза целлюлозосодержащего сырья в составе целлюлазного комплекса

Использование открытых несколько лет назад полисахаридмонооксигеназ (ПМО) в составе целлюлазных комплексов существенно увеличивает их осахаривающую способность. Методом генетической инженерии нами был получен химерный фермент на основе ПМО Thielavia terrestris, к С-концу которого присоединен через пептидный линкер целлюлозосвязывающий модуль (ЦСМ) от целлобиогидролазы I Penicillium verruculosum. Химерная ПМО обладала более высокой (на 24 %) активностью по отношению к аморфной целлюлозе и расширенной субстратной специфичностью по сравнению с исходной ПМО. В результате присоединения ЦСМ химерная ПМО приобрела способность расщеплять помимо целлюлозы и β-глюкана ксилан и карбоксиметилцеллюлозу, а ее активность по отношению к ксилоглюкану возросла на порядок. При замене 10 % высокоактивного целлюлазного препарата hBGL2, продуцируемого P. verruculosum, на химерную ПМО при сохранении общей дозировки ферментов по концентрации белка выход сахаров при гидролизе микрокристаллической целлюлозы и измельченной осиновой древесины увеличился на 24 и 47 % соответственно, причем при деструкции древесины максимальный выход сахаров был достигнут через 24 ч реакции в отличие от гидролиза указанным препаратом без добавки ПМО, длящегося 48 ч.

1. Margeot A., Hahn-Hagerdal B., Edlund M., Slade R., Monot F. // Current Opinion in Biotechnology. 2009. Vol. 20. P. 372—380.

2. Merino S.T., Cherry J. // Advances in Biochemical Engineering/ Biotechnology. 2007. Vol. 108. P. 95—120.

3. Sims R.E.H., Mabee W., Saddler J.N., Taylor M. // Bioresource Technology. 2010. Vol. 101. P. 1570—1580.

4. Zifcakova. L., Baldrian P. // Fungal Ecology. 2012. Vol. 5. P. 481—489. 5. Kim I.J., Nam K.H., Yun E.J., Kim S., Youn H.J., Lee H.J., Choi I.G., Kim K.H. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2015. Vol. 99. P. 8537—8547.

5. Proskurina O.V., Korotkova O.G., Rozhkova A.M., Kondrat'eva E.G., Matys V.Y., Zorov I.N., Koshelev A.V., Okunev O.N., Nemashkalov V.A., Bubnova T.V., Sinitsyn A.P. // Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. Vol. 51. P. 666—673.

6. Булахов А.Г., Гусаков А.В., Чекушина А.В., Сатрутдинов А.Д., Кошелев А.В., Матыс В.Ю., Синицын А.П. // Биохимия. 2016. Т. 81. С. 530—537.

7. Phillips M.C., Beeson W.T., Cate J.H.D., Marletta M.A. // ACS Chemical Biology. 2011. Vol. 6. P. 1399—1406.

8. Levasseur A., Drula, E., Lombard, V., Coutinho P.M., Henrissat B. // Biotechnology for Biofuels. 2013. Vol. 6. No. 41. P. 1—14.

9. Quinlan R.J., Sweeney M.D., Leggio L.L., Otten H., Poulsen J.C., Johansen K.S., Krogh K.B., Jorgensen C.I., Tovborg M., Anthonsen A., Tryfona T., Walter C.P., Dupree P., Xu F., Davies G.J., Walton P.H. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 2011. Vol. 108, P. 15079—15084.

10. Tanghe M., Danneels B., Camattari A., Glieder A., Vandenberghe I., Devreese B., Stals I., Desmet T. // Molecular Biotechnology. 2015. Vol. 57. P. 1010—1017.

11. Morozova V.V., Gusakov A.V., Andrianov R.M., Pravilnikov A.G., Osipov D.O., Sinitsyn A.P. // Journal of Biotechnology. 2010. Vol. 5. P. 871—880.

12. Crouch L.I., Labourel A., Walton P.H., Davies G.J., Gilbert H.J. // The Journal of Biological Chemistry. 2016. Vol. 291. No. 14, P. 7439—7449.

13. Пат. РФ 2378372. 10.01.2010; Бюл. № 1.

14. Dotsenko A.S., Gusakov A.V., Volkov P.V., Rozhkova A.M., Sinitsyn A.P. // Biotechnology and Bioengineering. 2016. Vol. 113. P. 283-291.

15. Aslanidis C., de Jong P.J. // Nucleic Acids Research. 1990. Vol. 18. P. 6069—6074.

16. Sanger F., Nicklen S., Chase A.R. // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 1977. Vol. 74. Р. 5463—5467.

17. Мерзлов Д.А., Зоров И.Н., Доценко Г.С., Денисенко Ю.А., Рожкова А.М., Сатрутдинов А.Д., Рубцова Е.А., Кондратьева Е.Г, Синицын А.П. // Биохимия. 2015. Т. 80, № 4. С. 556—567.

18. Aleksenko A., Makarova N., Nikolaev I., Clutterbuck A. // Current Genetics. 1995. Vol. 28. P. 474—478.

19. James P.E. Proteome Research: Mass Spectrometry. Berlin: Springer-Verlag. 2001. 274 p.

20. Bulakhov A.G., Volkov P.V., Rozhkova A.M., Gusakov A.V., Nemashkalov V.A., Satrutdinov A.D., Sinitsyn A.P. Using an inducible promoter of a gene encoding Penicillium verruculosum glucoamylase for production of enzyme preparations with enhanced cellulase performance // PLoS ONE. 2017. Vol. 12. No. 1. e0170404.

21. Синицын А.П., Черноглазов В.М., Гусаков А.В. Методы изучения и свойства целлюлолитических ферментов. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1990. Т. 25. С. 30—37.

22. Frommhagen M., Sforza S., Westphal A.H., Visser J., Hinz S.W.A., Koetsier M.J., van Berkel W.J.H., Gruppen H., Kabel M.A. // Biotechnology for Biofuels. 2015. Vol. 8. No. 101. P. 1-12.